Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng ochratoxin A và aflatoxin B1 trong hạt cà phê bằng phương pháp LC-MS/MS

Tên tiếng Việt: Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng ochratoxin A và aflatoxin B1 trong hạt cà phê bằng phương pháp LC-MS/MS

Tên tiếng Anh: Simultaneous determination of ochratoxin and aflatoxin B1 in roasted coffee by LC-MS/MS

Lĩnh vực: Nghiên cứu – Kỹ thuật

Từ khóa: Mycotoxins; Aflatoxin B1; Ochratoxin A; immunoaffinity column; LC-MS/MS; hạt cà phê;

Tóm tắt tiếng Việt:

            Cà phê là một thức uống rất thông dụng và được yêu thích bởi nhiều lợi ích có lợi cho sức khỏe, nhưng lại bị phát hiện gây ngộ độc, đặc biệt là ung thư gan và thận ở người. Nội độc tố chính được nghiên cứu nhiều trên cà phê là OTA. Ở Thái Lan năm 2000 có 44,29 % các mẫu bị nhiễm OTA khi phân tích 128 mẫu cà phê. Trong nghiên cứu của Ilic và CS. năm 2007 trên hạt cà phê Robusta của Việt Nam, phát hiện nhiều mẫu nhiễm OTA là do A. niger. Tuy nhiên, những nghiên cứu về AFB1 trên cà phê vẫn còn hạn chế, mặc dù đây là độc tố độc tính cao và khá phổ biến. Đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu phân tích đồng thời OTA và AFB1 trên hạt cà phê ở Việt Nam.

            Để kiểm soát mức độ nhiễm các nội độc tố này, có nhiều phương pháp phân tích từ đơn giản đến hiện đại được phát triển như: Miễn dịch liên kết enzym (ELISA), sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò huỳnh quang (LC-FD), hay đầu dò khối phổ LC-MS/MS. Trong đó, phương pháp LC-FD được sử dụng khá phổ biến cho phân tích một thành phần nội độc tố với độ nhạy đạt từ 0,01 ng/mL đến vài ng/mL, tuy nhiên phương pháp cần thiết tạo dẫn xuất thích hợp và đòi hỏi nền mẫu phải được xử lý tốt và sẽ gặp khó khăn khi phân tích đồng thời nhiều nội độc tố ở nồng độ phân tích vết. Hiện nay, phương pháp LC-MS/MS được ứng dụng ngày càng nhiều trong lĩnh vực phân tích vết của các nội độc tố, cho phép phân tích đồng thời  nhiều thành phần với độ nhạy, độ chính xác cao, đặc biệt đây là phương pháp được sử dụng trong các nghiên cứu nhằm xác định lại kết quả dương tính cho các phương pháp khác như ELISA và HPLC-FLD. Do đó, việc phát triển phương pháp LC-MS/MS phân tích đồng thời 2 loại nội độc tố phổ biến, có độc tính cao OTA, AFB1 trong cà phê có tính mới và ý nghĩa thực tiễn cao.

            Đối tượng nghiên cứu

            Gồm 2 nội độc tố: Ochratoxin A (OTA) và aflatoxin B1 (AFB1).

Phương pháp nghiên cứu

Hỗn hợp chuẩn OTA, AFB1 và chuẩn nội AFB2 được pha trong methanol đến nồng độ khoảng 200 ppb và bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ Xevo TQD, sử dụng chế độ Auto tune trong phần mềm Masslynx 4.1.

            Kết luận

            Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời 2 loại nội độc tố phổ biến và độc tính cao trong nhóm bằng phương pháp LC-MS/MS. Quy trình định lượng này đã được thẩm định đạt theo hướng dẫn của AOAC. Quy trình phân tích có tính chọn lọc, chính xác và tin cậy cao. Quy trình được ứng dụng vào thực tế để kiểm tra 30 mẫu cà phê được thu mua tại các cơ sở kinh doanh cà phê của TP. Cần Thơ. Kết quả phát hiện 2 mẫu có lượng OTA và 1 mẫu có lượng AFB1 vượt mức MRL (5 ppb). Các mẫu dương tính khác nằm trong giới hạn cho phép.

Tóm tắt tiếng Anh

            A high specificity, sensitivity and reliable successfully

A reversed-phase LC-MS/MS method for simultaneous determination of aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA) in roasted coffee beans was optimally developed, as: Column – Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 mm x 4.6 mm x 3.5 µm); Mobile phase – Methanol-water containing formic acid pH 2.4 (9:1), in isocratic mode. R-biopharm Ochrarhone Wide and Aflarhone Wide immunoaffinity column for roasted coffee beans sample preparation, which were extracted with 1 % sodium hydrocarbonate, sodium chloride and 70 % methanol; Flow rate – 0.5 mL/min; Injection volume – 10 μL. Electrospray ionization source was operated in positive mode and multi reaction monitoring (MRM) mode using the transition of m/z 426.14 ® 260.92 m/z, 313.14 ® 284.88 m/z and 315.14 ® 287.01 m/z were used to quantify OTA, AFB1 and AFB2 (IS), respectively. Validated basing on AOAC and EC-657/2002 guideline, the method proved to meet the requirements of wide linearity range (1-200 ppb) and high correlation coefficient (R² > 0.99), very good accuracy (recovery rate – 88.62-109.10 %) and intra-day precision (RSD < 7.06 %) and typical LOD, LOQ values of 0.02 ppb and 0.05 ppb for OTA, 0.01 ppb and 0.05ppb for AFB1, respectively. On analysis of real samples, the method revealed more than 43 % of samples were positive for OTA and 20 % of samples positive for AFB1 with two samples containing OTA and one sample containing AFB1 in concentration surpassing that of Vietnam Ministry of Healths MRLs.